HPLC

A.    JUDUL

HIGH PERFORMANCE LIQIUD CHROMATOGRAPH (HPLC)

              HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

         HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.

     Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

B.     TUJUAN

Mengetahui kadar asam organik.Memisahkan komponen berdasarkan pada fase gerak dan fase diamnya dan dapat didasarkan juga prinsipnya padak kromatografi kolom. bahkan Komponen berdasarkan pada fase gerak dan fase diamnya dan dapat didasarkan juga prinsipnya pada kromatografi kolom.

C.    PRINSIP KERJA

Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih baik dan efisien.

Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

D.    SKEMA ATAU BAGIAN-BAGIAN ALAT DAN FUNGSINYA

Keterangan :

1.      Botol pelarut (reservoir)

Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2.      Pompa (pump)

Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.

3.      Injektor (injector)

Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.

4.      Kolom (coloum)

Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.

 Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1)      Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2)      Kolom preparatif: umumnya memiliki  diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung  pada model KCKT  yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,  LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography,  IEC, Exclution Chromatography, EC)

5.      Detektor (detector)

            Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan  untuk mendeteksi banyak  senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang  sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

6.      Komputer (PC) dan Printer

Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.

E.     CARA KERJA

1.      Semua komponen dari HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) dihubungkan terlebih dahulu ke power supply.

2.      Pompa  atau kompresor dinyalakan.

3.      Detektor dinyalakan, komputer dinyalakan, printer dinyalakan karena untuk mengeprint hasil langsung. Tunggu hingga 15 menit terlebih dahulu.

4.       Lampu yang berwarna merah menyala pada saat dinyalakan, ketika sudah menyala barulah berwarna hijau.

5.       Setelah komponen menyala, LC solution yang terdapat dalam komputer dibuka, karena hanya ada satu LC maka klik LC no 1.

6.      Setelah itu akan muncul bagian pengaturnya cara pengaturannya yaitu klik metode, kemudian instrument, parameter seperti komposisi eluen, laju aliran, detektor, dan lamanya waktu analisis diatur.

7.      Dalam pengaturan, diatur secara bertahap tidak boleh langsung sesuai dengan yang diinginkan.

8.       Mode pada software LC solution terdapat 2 pilihan yaitu, pertama iso kratik, iso kratik adalah pengaturan dimana eluen dari awal sampai akhir penggunaan eluen akan sama. Kedua adalah gradien, yaitu ada tingkatan dimana eluen untuk elusinya dirubah.

9.      Klik detektor uv pada panjang gelombang 254 nm, klik end time. Perhatikan pembacaan detektor.

10.  cara penginjeksian sampel dilakukan. Penginjeksian sampel dimulai dengan syringe atau alat penginjeksian dibersihkan terlebih dahulu, kemudian setelah bersih dicuci dengan pelarut yang akan digunakan.

11.  Klik single star, injeksi run lalu equation information.

12.  Terdapat dua pilihan dalam penginjeksian yaitu automatic sample atau mengambil sendiri sampel, atau menginject dengan sendirinya, dan yang kedua adalah injection volume (jumlah sampel yang ingin diinjeksikan).

Pada peroses peninjeksian syringe dimasukkan pada bagian injeksi secara tegak dan jangan sampai jarumnya bengkok.

13.  Kemudian tombol pada tempat injeksi diputar ke arah load, keluarkan cairan, dan terakhir putar ke arah injek, lalu keluarkan jarum secara hati-hati.

Diagram alir HPLC

Adapun cara untuk melihat seluruh prosesdiagram alir HPLC, antara lain:

a.    Injeksi sample

               Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

b.    Waktu retensi

        Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

c.    Detektor

         Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

d.    Interpretasi output dari detector

         Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama

F.      INTERPRETASI HASIL

Interpretasi hasil HPLC berupa angka dan kurva.

G.    GAMBAR ALAT